Голодание повышает эффективность терапии рака молочной железы за счет активации глюкокортикоидов

Аннотация

Большинство случаев рака молочной железы вызвано активацией эстрогенового рецептора-α (ERα), и эндокринная терапия остается основным методом лечения таких пациентов. Однако резистентность к терапии развивается часто, приводя к прогрессии опухоли через годы после начала подавления гормонов. Периодическое голодание повышает эффективность стандартной эндокринной терапии и отсрочивает приобретенную резистентность к препаратам, хотя механизмы этого явления до сих пор неясны. В этой работе мы демонстрируем, что голодание вызывает обширную эпигенетическую перестройку в ксенографтах ERα-положительного рака молочной железы при комбинации с эндокринной терапией. Это включает крупномасштабную активацию сигнальных путей глюкокортикоидного рецептора (GR) и прогестеронового рецептора, а также снижение активности факторов семейства activator protein-1 (AP-1). Программы генов, регулируемые GR, селективно активируются в in vivo-моделях ERα-положительного рака молочной железы во время голодания, и knockout GR препятствует антиопухолевым эффектам комбинации голодания с тамоксифеном. Введение экзогенных лигандов GR воспроизводит усиление антиэстрогенного действия голодания, способствуя регрессу опухоли. У пациентов, проходящих циклическую диету, имитирующую голодание (FMD), наблюдалось повышение концентраций прогестерона и кортизола в крови. Кроме того, опухоли, собранные после FMD, демонстрировали обратную корреляцию между активацией GR и маркерами пролиферации, подтверждая наши наблюдения на моделях животных. Результаты указывают на ключевую роль активации GR в способности голодания усиливать активность эндокринной терапии при раке молочной железы и предполагают, что введение кортикостероидов следует оценить как адъювантную терапию в этом контексте.

Введение

Гормон-рецептор-положительный (HR+) рак молочной железы составляет около 75% всех случаев заболевания, и эндокринные терапии – это краеугольный камень лечения как на адъювантном, так и на метастатическом этапах. Тем не менее, эффективность стандартных эндокринных терапий ограничена первичной или приобретенной резистентностью. Периодическое голодание усиливает действие эндокринных терапий против HR+ рака молочной железы и замедляет развитие резистентности в моделях на животных. Клинические исследования показывают, что циклы водного голодания или диет, имитирующих голодание (FMD – низкокалорийные, низкобелковые и низкоуглеводные веганские диеты, воспроизводящие метаболические эффекты голодания), осуществимы и безопасны для пациентов с различными типами опухолей, включая рак молочной железы, меланому, колоректальный рак, рак легких и гинекологические опухоли. Ранее мы сообщали, что голодание повышает эффективность эндокринных терапий при HR+ раке молочной железы. Однако механизмы этого эффекта остаются неизвестными. Более того, адъювантные эндокринные режимы предполагают 5–10 лет непрерывного ежедневного лечения, что делает длительную комбинированную диетическую интервенцию во время эндокринной терапии крайне сложной для соблюдения. В этой работе мы исследовали биологические механизмы, лежащие в основе усиления эффективности тамоксифена (TMX) голоданием – одним из наиболее широко используемых эндокринных препаратов, – с целью выявления терапевтических стратегий, которые могли бы имитировать полезные эффекты голодания или FMD у пациентов с HR+ раком молочной железы и потенциально заменить их.

Методы

Эксперименты на животных

Эксперименты проводились в соответствии с институциональными рекомендациями (Принципы ухода за лабораторными животными, директива 86/609/EEC). Одобрены Итальянским институтом высшего здоровья и Комитетом по этике животных Нидерландского института рака. Использовались самки атymic nude мышей (возраст 6–8 недель), ксенографтированные клетками MCF7 (подкожно или ортотопически). Лечение: контроль (диета ad libitum), TMX (45 мг/кг/день перорально), голодание (48 ч еженедельно только вода), дексаметазон (Dexa; 4 мг/кг через день внутрибрюшинно). Ксенографты устанавливались подкожной инъекцией 5 × 10^6 клеток MCF7 или ортотопической инъекцией. Объем опухоли рассчитывался как (w^2 × W) × π/6 (w и W – минорная/мажорная оси). Мультиомикс-анализ: транскриптомика, протеомика, иммуногистохимия, ChIP-seq для H3K27ac и факторов транскрипции. Knockout GR (GR-KO) с помощью CRISPR-Cas9 в клетках MCF7. Сбор крови для уровней кортикостерона/прогестерона методом ELISA. Статистический анализ: модель с смешанными эффектами для роста опухоли, t-тесты, ANOVA.

Клинические исследования

NCT05748704 (фаза I/II, FMD с эндокринной терапией; n=15 пациентов) и NCT03454282 (исследование DigesT; n=35 пациентов). FMD: 5-дневная низкокалорийная (800–1000 ккал/день), низкобелковая, низкоуглеводная веганская диета. Кровь/сыворотка для кортизола/прогестерона методом ELISA. Образцы опухолей для RNA-seq (до/после FMD). Анализы: DESeq2 для дифференциальной экспрессии, GSEA для обогащения путей, GSVA для активности сигнатур.

ChIP-seq

Проводился на ксенографтах опухолей. Антитела для ERα, H3K27ac, GR, PR, JUN. Секвенирование на Illumina NovaSeq. Анализ: выравнивание BWA, вызов пиков MACS2, diffBind для дифференциальных пиков.

RNA-seq

Изоляция из опухолей с помощью RNeasy kit. Библиотеки TruSeq Stranded mRNA. Анализ: выравнивание HISAT2, DESeq2 для дифференциальной экспрессии, GSEA для Hallmarks/сигнатуры GR.

Протеомика

Триптическая дигестия, LC-MS/MS на Orbitrap. Анализ: DIA-NN, Perseus для дифференциальной экспрессии, GSEA.

Другие методы

Иммуногистохимия (IHC) на Ventana autostainer для ERα, GR, PR, Ki-67. Иммунофлуоресценция для GR. Потоковая цитометрия для профилирования иммунитета (например, PD-L1 на нейтрофилах, моноцитах).

Результаты

Голодание перепрограммирует эпигеном опухоли

В ксенографтах MCF7 еженедельное 48-часовое голодание в комбинации с TMX синергетически снижало рост опухоли (n=6 на группу; P<0,05 по модели с смешанными эффектами). ChIP-seq H3K27ac показал глубокую эпигеномную перестройку. Сайты, затронутые голоданием, обогащены потерей AP-1 семейства (FOSL2, JUN и др.) и приобретением ERα, GR, PR, AR. Ингибирование AP-1 блокировало пролиферацию в клетках MCF7/T47D.

Голодание активирует внутриопухолевый GR и PR

IHC показала рост ядерного GR при голодании (n=4). ChIP-seq подтвердил увеличение связывания GR/PR с хроматином. Связывание JUN не менялось на потерянных сайтах H3K27ac и отсутствовало на приобретенных. Голодание/FMD повышало кортикостерон/прогестерон в крови мышей и кортизол/прогестерон у пациентов (P<0,05). Введение факторов, снижаемых голоданием (IGF1, инсулин, лептин), предотвращало рост гормонов и антиопухолевые эффекты.

Голодание активирует гены, регулируемые GR

RNA-seq показал ингибирование путей MYC/E2F/mTOR при TMX+голодании. Сигнатура активности GR повышена (NES положительный, P<0,05). ZBTB16 (PLZF) сильно upregulated с ростом оккупации GR/PR. В опухолях пациентов после FMD активность GR повышена и обратно коррелировала с маркерами пролиферации (E2F/G2M; R отрицательный, P<0,05). Активность PR также росла.

Активация GR имитирует эффекты голодания

GR-KO устранял синергию TMX+голодания (P>0,05 vs. контроль в KO). Dexa+TMX воспроизводил TMX+голодание в MCF7, T47D и PDX (IDC186). Эффект сохранялся после отмены. Dexa снижал IGF1, предотвращал гиперплазию, индуцированную TMX. В иммунокомпетентной модели TSAE1 Dexa+TMX снижало рост и повышало выживаемость (P<0,05 log-rank), с снижением PD-L1 на иммунных клетках.

Ключевые данные: Кривы роста опухолей (среднее ± s.e.m.; P<0,05); тепловые карты H3K27ac; уровни гормонов (P<0,05); вулкановые графики (NES, P<0,05).

Обсуждение

Диетические ограничения, такие как голодание или FMD, обещают антиопухолевые эффекты через множественные механизмы, но проблемы с соблюдением остаются. Исследование показывает, что агонисты GR, как Dexa, имитируют голодание, усиливая эндокринную терапию через активацию GR/PR и снижение AP-1. Стеридные гормональные рецепторы (GR, PR) взаимодействуют с ERα; голодание повышает кортизол/прогестерон, активируя опухоль-супрессивные программы. Агонисты PR тестируются в клинических испытаниях (например, NCT03306472); активация GR способствует люминальному фенотипу. Хронические кортикостероиды имеют побочные эффекты, но Dexa+TMX безопасны в моделях, с потенциальными иммуно-преимуществами (снижение PD-L1). Предыдущие испытания ограничивались не-HR+ пациентами. Предлагаем введение глюкокортикоидов как мимикрина голодания для HR+ рака молочной железы.

Голодание усиливает эндокринную терапию при HR+ раке молочной железы через активацию GR, повышая кортизол/прогестерон и перепрограммируя эпигеном (снижение AP-1, приобретение GR/PR). Knockout GR блокирует эффекты; Dexa имитирует голодание, способствуя регрессу. Клиническая FMD повышает гормоны и коррелирует GR с снижением пролиферации. Импликации: Кортикостероиды как адъюванты к эндокринной терапии, обходя проблемы соблюдения диеты, потенциально улучшая исходы при HR+ раке молочной железы.